数据标准化与归一化

测序深度差异是微生物组分析的核心技术挑战之一。不同样本的 reads 数量可能相差数十倍，直接比较丰度会产生偏差。

为什么需要标准化？

样本A: 总 reads = 50,000  → OTU_X = 500 reads (1%)
样本B: 总 reads = 500,000 → OTU_X = 2000 reads (0.4%)

OTU_X 在样本B中 reads 数是A的4倍，但相对丰度反而更低！

主要方法对比

方法	原理	优点	缺点	适用场景
Rarefaction	随机抽样到最小深度	简单直观	丢弃数据，统计效力降低	Alpha 多样性
CSS (Cumulative Sum Scaling)	累积求和缩放	保留零值	对假阳性敏感	QIIME / metagenomeSeq
TMM (Trimmed Mean of M-values)	修剪均值	适用于 RNA-seq	假设大部分特征不变	edgeR
CLR (Centered Log-Ratio)	几何均值为中心的对数比	组成性数据分析	不能处理零值	ANCOM-BC, ALDEx2
RLE (Relative Log Expression)	相对对数表达	稳健	假设大部分特征不变	DESeq2
CPM (Counts Per Million)	简单比例缩放	快速	不校正组成性偏差	初步探索

Rarefaction（稀释）

最直观的方法：将所有样本随机抽样到相同深度。

# R (phyloseq)
ps_rare <- rarefy_even_depth(ps, sample.size = 10000, rngseed = 42)

# Python (scikit-biomove)
from biomove import rarefy
rarefied = rarefy(table, depth=10000)

⚠️ 注意: Rarefaction 会丢弃数据，且每次结果不同（需设随机种子）。不推荐用于差异丰度分析。

CLR 变换

CoDA 方法的核心：

# R (microbiome package)
clr_transformed <- microbiome::transform(ps, "clr")

# Python
import numpy as np
def clr(x):
    log_x = np.log(x + 1e-6)  # 伪计数
    return log_x - np.mean(log_x)

实践建议

1. Alpha 多样性: 使用 rarefaction 统一深度
2. 差异丰度分析: 使用方法内置的标准化（ANCOM-BC, DESeq2, ALDEx2 各自处理）
3. 可视化: 探索性分析可简单用比例（percentages）
4. 不要叠加: 不要先 rarefy 再用 DESeq2 — 选一种方法坚持到底

参考文献

1. McMurdie & Holmes (2014) Waste not, want not: why rarefying microbiome data is inadmissible. PLOS Computational Biology. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1003531
2. Gloor et al. (2017) Microbiome Datasets Are Compositional. Frontiers in Microbiology. DOI: 10.3389/fmicb.2017.02224
3. Weiss et al. (2017) Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. DOI: 10.1186/s40168-017-0237-y

---

最后更新: 2026-03-30